Поймать гигантский белок: пять новых способов захватить хантингтин

Болезнь Хантингтона (БХ) вызвана изменением в одном гене, известном как хантингтин. Этот ген содержит инструкции для производства белка хантингтина. Несмотря на то что прошло более трёх десятилетий с момента открытия гена БХ, учёные всё ещё пытаются выяснить, что именно делает белок хантингтин в здоровых клетках и как версия БХ вызывает заболевание.

Одна из причин столь медленного прогресса заключается в том, что хантингтин действительно сложно изучать. Он огромен, свёрнут сложным образом, и инструменты, которыми располагали учёные, не очень хорошо справлялись с его захватом. В новом исследовании команда из Канады и Японии создала совершенно новые химические инструменты: крошечные кольца из белка, называемые макроциклами, которые могут захватывать хантингтин в пяти различных точках. Итак, что они создали, что узнали и почему это важно для БХ?

Гигантский белок, который трудно увидеть

Чтобы понять эту проблему, полезно представить себе хантингтин. Если большинство белков похожи на обычные бытовые приборы с одной функцией, то хантингтин больше напоминает целую кухню — созданную для поддержки множества различных задач одновременно.

Это очень длинная цепь, которая сворачивается в два больших сгустка, соединённых гибким мостиком. Генетическое изменение, вызывающее БХ, находится в самом начале белка хантингтина, где короткий повторяющийся сегмент (состоящий из строительного блока, называемого глутамином) становится аномально расширенным. У людей обычно около 20–35 таких глутаминов; при БХ это число превышает 35 и может достигать 50, 80 или более.

Хантингтин выполняет множество функций в организме. Он помогает перемещать вещества внутри клеток, позволяет клеткам делиться и очищает мусор. Но мы не знаем точно, как он делает всё это.

Мы точно знаем одно: у хантингтина есть лучший друг под названием HAP40, меньший белок, который прикрепляется к нему, известный как партнёр по связыванию. До сих пор HAP40 был единственным партнёром по связыванию, для которого у учёных есть детальная структурная картина. Определение того, что ещё делает хантингтин и с кем, было ограничено отсутствием точных, специфических инструментов для его захвата.

Создание молекулярных крюков

Чтобы создать лучшие инструменты, учёные использовали умную систему под названием RaPID. Представьте себе RaPID как огромную вечеринку быстрых знакомств между крошечными пептидами (маленькими кусочками белка) и хантингтином. Команда создала супергигантскую коллекцию из примерно одного триллиона различных крошечных пептидов — это 1 с 12 нулями!

Каждый пептид был согнут в замкнутое кольцо, что-то вроде резинки. Петлеобразная или свёрнутая форма может захватывать вещи легче, чем прямая нить, подобно тому как согнутая скрепка может цепляться за объекты, в то время как прямая проволока просто скользит мимо.

У каждого маленького пептидного кольца была своя бирка с именем (сделанная из ДНК), прикреплённая к нему. Поэтому, когда кольцо связывалось с хантингтином, учёные могли прочитать его бирку и точно знать, какой это пептид. Они провели несколько раундов «рыбалки», чтобы подвергнуть коллекцию кольцевых пептидов воздействию хантингтина, либо отдельно, либо связанного со своим другом HAP40. Они сузили пул только до самых липких, и пять кольцевых пептидов оказались лучшими связывателями хантингтина: HL2, HL5, HD4, HHL1 и HHD3.

Точное определение места прикрепления каждого пептидного кольца

Найти пептидные кольца, которые прикрепляются к хантингтину, — это только первый шаг. Далее учёные хотели узнать, где именно каждое из них захватывает хантингтин и насколько крепко. Они использовали три интересных метода, чтобы это выяснить:

• Тесты, которые измеряют, насколько сильно кольца удерживаются. Все пять колец держались очень крепко, достаточно сильно, чтобы быть полезными инструментами, и, возможно, даже отправной точкой для потенциальных лекарств, которые могли бы вылавливать токсичный хантингтин.
• Метод под названием HDX-MS, который показывает, какие части белка покрываются, когда кольцо прикрепляется к нему. Когда кольцо присоединяется к хантингтину, оно защищает определённые участки, оставляя «отпечаток», который помогает учёным выяснить, где приземляется кольцо.
• Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ), которая представляет собой сверхмощный микроскоп, замораживающий белки и создающий 3D-изображения настолько чёткие, что можно увидеть отдельные атомы. (Да, это так же круто, как звучит.) Это показало точные контакты, которые каждый пептид образует с белком хантингтином.

Вот что они обнаружили: два кольца (HL2 и HD4) захватывают хантингтин в местах, далёких от его лучшего друга HAP40.

Два других кольца (HHL1 и HHD3) работают только тогда, когда присутствует HAP40, втискиваясь в маленький карман прямо между двумя друзьями и складываясь в форму, похожую на цифру 8, чтобы поместиться.

Последнее кольцо (HL5) любит хантингтин только тогда, когда он один, без HAP40.

И вот важный момент: пять колец захватывали здоровый хантингтин и расширенный хантингтин одинаково хорошо, что особенно полезно в инструменте, предназначенном для изучения белка как в здоровых, так и в больных клетках.

Вылавливание друзей хантингтина в реальных клетках

Полезные инструменты должны работать в реальной жизни, а не только в пробирках. Поэтому учёные добавили маленький крючок (называемый биотином) к своим пептидным кольцам, как рыболовный крючок на леске. Учёные использовали эти пептиды в качестве приманки, чтобы посмотреть, смогут ли они поймать хантингтин в человеческих клетках, выращенных в чашках, вместе со всем остальным, что к нему прикреплено.

Один друг хантингтина выделялся намного больше остальных — HAP40. Он появлялся снова и снова, в каждом типе клеток, который пробовали учёные, включая клетки, похожие на мозговые, которые похожи на те, что повреждаются при БХ. Даже в клетках с более длинными CAG-повторами (например, Q45 или Q81) хантингтин всегда имел прикреплённый к нему HAP40.

Сообщалось о более чем 3 000 других белков, которые контактируют с хантингтином, но этот эксперимент показывает, что HAP40 — это тот, который действительно присутствует всё время. Это убедительно свидетельствует о том, что хантингтин и HAP40 функционируют как единое целое большую часть времени, и «настоящая» форма хантингтина внутри клеток почти всегда может быть парой хантингтин–HAP40.

Почему это важно для болезни Хантингтона

Эти новые кольца ещё не являются лекарствами, и учёные осторожны и не утверждают, что они таковыми являются. Но они открывают множество захватывающих дверей.

Во-первых, они работают так же хорошо, как инструменты, которые учёные использовали раньше для прикрепления и визуализации хантингтина (называемые антителами), но они меньше, дешевле и могут захватывать множество различных частей хантингтина, а не только одну. Они также достаточно малы, чтобы, возможно, проникать внутрь живых клеток и связываться с хантингтином, чего современные антитела делать не могут. Это позволило бы учёным изучать хантингтин внутри живых клеток способами, которые в настоящее время невозможны.

Во-вторых, 3D-изображения высокого разрешения этих пептидных колец, прикрепляющихся к хантингтину, подобны чертежам для разработки будущих лекарств. Например, форма в виде восьмёрки показывает два маленьких кармана в точке встречи хантингтина и HAP40, на которые могут быть нацелены будущие лекарства, потенциально для «вылавливания» токсичного хантингтина. Кольца также могут использоваться в качестве «захватывающей» части новых интересных инструментов, таких как PROTAC (инструменты, которые говорят клетке выбросить хантингтин в мусор) или ПЭТ-трейсеры, которые могли бы помочь врачам визуализировать хантингтин внутри мозга пациентов.

В-третьих, тот факт, что хантингтин почти всегда находится с HAP40 внутри клеток, переосмысливает то, как мы должны к нему подходить. Если мы хотим понять, что делает хантингтин, или как его исправить, когда он изменяется и становится токсичным, нам, вероятно, нужно изучать его с HAP40, а не отдельно. Теперь у учёных есть более точный набор инструментов для исследования загадки того, может ли хантингтин функционировать без HAP40.

Взгляд в будущее

Как и вся наука, эта статья оставляет множество вопросов. Кольца захватывают здоровый и БХ хантингтин одинаково, поэтому они пока не могут сказать нам, как нацеливаться только на вредный вид, над чем исследователи всё ещё работают.

Следующими шагами будет их тестирование внутри живых животных и их переработка для проникновения в клетки. Также были обнаружены некоторые новые возможные партнёры по связыванию хантингтина, такие как ACADVL и HEY1, для которых необходимы дополнительные тесты для подтверждения.

Это исследование даёт сообществу БХ совершенно новый набор инструментов для белка, который было действительно трудно захватить. Точно так же, как удивительные микроскопы изменили то, что могли видеть учёные, эти крошечные пептидные кольца обещают преобразовать то, что мы можем спросить о функции хантингтина, в здоровье, при заболевании и в поисках лечения.

Резюме

• Болезнь Хантингтона (БХ) вызвана изменением, которое делает белок хантингтин аномально длинным. Учёные до сих пор не знают полностью, что делает этот белок, потому что он огромен и его трудно изучать с помощью существующих инструментов.
• Используя систему под названием RaPID, команда протестировала около одного триллиона крошечных кольцеобразных белковых фрагментов и определила пять, которые крепко и специфично прикрепляются к хантингтину, каждый в разном, чётко определённом месте.
• Микроскоп высокого разрешения показал точно, как кольца прикрепляются к хантингтину. Два из них даже складываются в интересную форму восьмёрки, чтобы поместиться в карман между хантингтином и его лучшим другом HAP40.
• Когда кольца использовались для «вылавливания» хантингтина из реальных человеческих клеток, они почти всегда ловили HAP40 вместе с ним, независимо от типа клеток или длины CAG-повтора.
• Эти кольца относительно дёшевы, малы и гибки, поэтому они могут помочь создать будущие лекарства от БХ, инструменты для визуализации мозга и новые способы уничтожения вредного хантингтина.