Выход в стартовый состав: роль MutLβ в экспансии повторов ДНК

Болезнь Хантингтона (БХ) вызвана экспансией кода ДНК — повторяющимся участком из букв C-A-G в гене хантингтина. Этот расширенный повтор не остаётся стабильным; он может становиться длиннее в определённых типах клеток, особенно в головном мозге, посредством процесса, называемого соматической экспансией. Белки репарации ДНК находятся в центре этого процесса. Хотя они предназначены для исправления генетических ошибок, при столкновении с длинными повторяющимися участками CAG белки репарации ДНК могут ошибочно заставить их становиться ещё длиннее.

За последнее десятилетие учёные тщательно исследовали, какие белки репарации ДНК участвуют в конкретных аспектах соматической экспансии. Благодаря этим накопленным знаниям сформировался стартовый состав ключевых белков репарации ДНК, наиболее причастных к БХ. В биологии обычным явлением является то, что группы или пары белков держатся вместе и работают как команда для достижения ключевых целей. Это называется белковым комплексом.

Один комплекс, который не получал слишком много внимания, — это MutLβ (произносится «мьют-эл-бета»). Новое исследование проливает свет на важнейшие роли белкового комплекса MutLβ в поддержке других ключевых игроков и усилении экспансии повторов. Результаты дают более чёткое представление о том, как репарация ДНК может выходить за пределы допустимого в повторяющихся областях ДНК и заставлять вызывающие заболевание повторы расти.

Кто играет на чемпионате мира по репарации ДНК?

В длинных повторяющихся областях нашего генетического кода могут формироваться структуры ДНК, которые требуют командных усилий для разрешения и распутывания. Обычно это совершенно нормальный процесс, но при БХ он может приводить к удлинению повторяющихся участков.

Эти структуры представляют собой петли ДНК, которые могут быть обнаружены белками репарации ДНК в наших клетках. Так же, как в футболе (soccer для нашей североамериканской аудитории), репарация ДНК — это командный вид спорта. Итак, кто именно является Месси и Роналду команды репарации ДНК при БХ? В этом исследовании учёные сосредоточились на:

• MutSβ, («мьют-эсс-бета») комплекс-защитник: Состоящий из белков MSH2 и MSH3, MutSβ патрулирует поле ДНК, ища необычные структуры или ошибки. Когда обнаруживается ошибка или структура, MutSβ атакует её и вызывает остальную часть команды. Обычно это защищает геномГеном — название, обозначающее все гены, которые содержат полные инструкции по созданию человека или другого организма., но при длинных повторах CAG вмешательство команды может привести к случайному автоголу и сделать повторы длиннее.
• MutLγ, («мьют-эл-гамма») комплекс-нападающий: Состоящий из MLH1 и MLH3, MutLγ несёт молекулярное лезвие. ДНК двухцепочечная, и как только MutSβ идентифицирует структуру и подаёт сигнал о поддержке, MutLγ делает надрез на цепи, противоположной петле ДНК. Представьте это как удар по воротам, создающий отверстие, необходимое для продвижения процесса экспансии.
• MutLβ, («мьют-эл-бета») комплекс-плеймейкер: Состоящий из MLH1 и PMS1, MutLβ связывает ключевых игроков вместе. В этом исследовании авторы обнаружили, что MutLβ взаимодействует с MutSβ и MutLγ, чтобы способствовать стимулированию экспансии повторов, подобно тому, как плеймейкер передаёт мяч, чтобы приблизиться к воротам.

На протяжении всего исследования учёные использовали биохимические подходы для тщательной проверки того, что делает каждый белковый комплекс. Они могут делать это, используя экстракты человеческих клеток, из которых удалены конкретные белки репарации ДНК. Затем учёные могут воссоздать части процесса репарации ДНК в пробирке, добавляя или удаляя отдельных игроков, чтобы увидеть, как изменяется результат.

Но как можно увидеть соматические экспансии в пробирке? Изящный трюк, который использовали авторы, заключался во встраивании скрытого сигнала рядом с небольшой синтетической петлёй ДНК. Если происходят экспансии, это создаёт специальную последовательность, которую можно разрезать ферментом. После разрезания фрагменты ДНК действуют как табло, указывающее, произошли ли экспансии или нет, и насколько!

MutLβ помогает команде репарации ДНК продвигать мяч вперёд к экспансиям.

Учёные сначала проверили, действительно ли MutLβ помогает повторам ДНК расширяться. Они использовали экстракты человеческих клеток без ключевых белков репарации ДНК, затем добавляли MutSβ, MutLγ и MutLβ в различных комбинациях и количествах.

Когда в системе не было MutSβ, экспансия оставалась на фоновом уровне, даже когда добавлялся MutLβ. Это имеет смысл, потому что без комплекса-защитника петля ДНК не распознаётся эффективно — и остальная часть команды не получает должного сигнала или активации. Когда MutSβ добавлялся на низких уровнях вместе с MutLγ, выведение MutLβ на поле увеличивало экспансию примерно в четыре-пять раз. Когда MutSβ добавлялся на более высоких уровнях, это всё равно давало реакции сильный толчок.

Затем учёные исследовали роль комплекса-нападающего, MutLγ. Когда MutLβ присоединялся к MutSβ и MutLγ на одном поле, количество экспансии ДНК также увеличивалось! При низких уровнях MutLγ и без MutLβ почти не происходило экспансии, но когда было доступно больше MutLγ, некоторая экспансия могла происходить сама по себе. Когда добавлялся MutLβ, вся реакция экспансии получала значительный толчок. В целом, когда команда работает вместе и все игроки доступны, MutLβ функционирует как плеймейкер, связывая действие и создавая дальнейшие экспансии.

MutLβ делает передачу, соединяя игроков и подготавливая разрез

Итак, как MutLβ стимулирует реакцию экспансии? Учёные изолировали отдельные белки и проверили, какие товарищи по команде находились вместе. Они обнаружили, что MutLβ физически взаимодействует с MutSβ, MutLγ и PCNA, другим белком, который помогает организовать репарацию ДНК.

Учёные также обнаружили, что MutLβ увеличивал режущую активность MutLγ. MutLγ разрезает цепь ДНК, противоположную петле, образованной в повторяющейся ДНК, создавая отверстие, которое позволяет процессу репарации двигаться вперёд в неправильном направлении и добавлять дополнительные повторы. Важно отметить, что MutLβ не просто делает MutSβ лучше в обнаружении петли. Вместо этого он действует позже в игре, выбирая время вмешательства, чтобы помочь MutLγ сделать разрез более эффективно. MutSβ идентифицирует опасность, MutLβ делает передачу, а MutLγ предпринимает финальное действие, создавая условия для того, чтобы произошла экспансия повторов.

Когда присутствуют все игроки

Клеточные экстракты содержат тысячи белков, поэтому может быть трудно узнать, помогает ли невидимый запасной игрок со скамейки. Чтобы проверить, достаточно ли выявленных игроков, учёные воссоздали реакцию экспансии повторов, используя только определённый набор белков в пробирке.

Система включала MutSβ и MutLγ наряду со всем необходимым механизмом для организации, копирования и обработки ДНК. Когда добавлялся MutLβ, экспансия повторов увеличивалась, а когда MutLγ был исключён, экспансия полностью исчезала, подтверждая, что MutLβ действует непосредственно в механизме экспансии.

Авторы также тестировали изменённые и дефектные версии некоторых из этих белков. Эти эксперименты дополнительно подтвердили идею о том, что взаимодействия MutLβ важны для его способности стимулировать экспансию.

Итак, каков вердикт, судья?

Это исследование переводит MutLβ из полунеизвестной величины в соматической экспансии в определённого члена ответственной команды. MutLβ, по-видимому, действует как плеймейкер, который помогает связать распознавание петли ДНК с действиями, которые создают более длинный повторяющийся участок ДНК.

Одним важным игроком, отсутствующим в реконструированной системе, был FAN1, белок репарации ДНК, который обычно защищает от соматической экспансии при БХ. Это исследование было разработано для выявления механизма, достаточного для производства экспансий, а не для воссоздания каждого белка, который может стимулировать или подавлять её. Это означает, что мы всё ещё не знаем, может ли FAN1 блокировать игру, конкурировать с MutLβ или изменять способ обработки петли.

Наконец, это строго контролируемые биохимические эксперименты с использованием клеточных экстрактов, очищенных белков и сконструированной ДНК — простые системы по сравнению с живыми, взаимосвязанными нейронами в человеческих телах. Очень полезно для выяснения того, что может делать каждый игрок, но не может полностью воспроизвести сложность игры чемпионата мира!

Выясняя точные роли этих белков репарации ДНК посредством биохимических исследований, основное преимущество заключается в тестировании того, что потенциально может быть нацелено для терапевтических вмешательств на животных моделях, а позже и на людях.

Резюме

• Проблема: Ранее функция MutLβ была неизвестна с точки зрения того, как он способствует экспансии повторов.
• Понимание: MutLβ, по-видимому, необходим для зависимой от MutSβ и MutLγ экспансии ДНК и, по-видимому, физически взаимодействует со многими игроками в механизме репарации неспаренных оснований.
• В лаборатории: Эта работа была выполнена в основном с биохимическими экспериментами и клеточными экстрактами в пробирках, а не на живых животных моделях.
• Почему это важно: Понимание того, как происходит экспансия повторов, какие именно игроки участвуют и что учёные могут безопасно нацелить в пути репарации ДНК, имеет важное значение для будущих терапий, нацеленных на игроков соматической экспансии.