Расстаньтесь со своими CAG: Как три буквы могут изменить болезнь Гентингтона

Болезнь Гентингтона (БГ) вызвана повторяющейся последовательностью генетических букв C-A-G в гене хантингтина (HTT) выше критического числа. Если число повторов превышает 40, то признаки и симптомы БГ начнутся в какой-то момент жизни человека, если он проживет достаточно долго. Вызывающая заболевание последовательность CAG расширяется на протяжении всей жизни, особенно в уязвимых клетках мозга, что, по мнению ученых, в конечном итоге вызывает гибель клеток.

В новом исследовании использовалось передовое редактирование генов для создания человеческих стволовых клеток с различной длиной CAG-повторов и генетической «орфографией». Затем они отслеживали, как эти повторы изменялись со временем, используя передовую технологию секвенирования. Команда обнаружила, что введение множественных генетических «прерываний» в CAG-повтор, разбивающих чистую последовательность CAG, принесло значительные преимущества. Что именно они обнаружили и что это означает для будущих методов лечения? Давайте узнаем!

Клеточная машина времени

Представьте, что вы наблюдаете за развитием болезни в замедленной съемке, чтобы отследить точный момент, когда все начинает идти не так. Именно это и создали исследователи из Миланского университета — платформу для наблюдения за развитием БГ на клеточном уровне, повтор за повтором, день за днем.

Команда под руководством доктора Елены Каттанео сконструировала человеческие стволовые клетки, несущие различные версии гена HTT. Используя редактирование генов CRISPR, они заменили последовательности HTT на последовательности с различной длиной CAG-повторов, от 21 повтора (ниже порога заболевания) до 107 повторов (в пределах диапазона заболевания).

Эту коллекцию клеточных линий они назвали «платформой CAGinSTEM», и она может стать мощным инструментом для понимания того, как CAG-повторы ведут себя со временем.

Наблюдение за ростом повторов

Одним из самых сложных аспектов изучения нестабильности CAG-повторов было точное измерение экспансии. Традиционные методы секвенирования могут испытывать трудности с повторяющейся ДНК. Представьте, что вы пытаетесь точно сосчитать 42 одинаковые буквы подряд. Вероятно, в какой-то момент вы можете задаться вопросом, было ли это 31 или 32, и вам придется начать заново. Тот же процесс происходит в эксперименте, когда молекулярные машины пытаются прочитать количество CAG-повторов.

Исследователи решили эту проблему, используя специализированный тип секвенирования, который может считывать очень длинные участки ДНК за один проход, сохраняя информацию о точном составе последовательности.

В течение 120 дней выращивания клеток в чашках команда наблюдала, что клетки, начинающиеся с 81 и 107 CAG-повторов, демонстрировали устойчивую, линейную экспансию своих повторов. Напротив, клетки с 45 или менее повторами оставались стабильными, без существенных изменений в числе CAG. Когда они превратили эти стволовые клетки в стриарные нейроны, наиболее пораженные при БГ клетки мозга, они увидели схожие паттерны: линия со 107 CAG-повторами демонстрировала экспансию даже в нейронах.

Изучение клеток до и после их превращения в нейроны позволило исследователям определить, влияет ли деление клеток на экспансию CAG. В то время как стволовые клетки делятся снова и снова, чтобы создать больше клеток, большинство нейронов этого не делают — они являются тем, что ученые называют «постмитотическими», что означает «после митоза» или «после деления клеток». Поскольку экспансия CAG оставалась на очень высоких числах повторов как до, так и после того, как клетки стали нейронами, это предполагает, что деление клеток не является способствующим фактором.

Сила прерывания

Вот тут-то исследование становится по-настоящему интересным. У большинства людей (более 95%) есть естественное прерывание в их CAG-повторе: он читается как CAG снова и снова до конца повторяющегося участка, где он читается как CAG-CAA-CAG, с этим единственным CAA в конце. Предыдущие исследования на людях показали, что потеря этого прерывания CAA приводит к более раннему началу заболевания, в то время как наличие дополнительного CAA задерживает начало.

Исследователи проверили это непосредственно на своей клеточной платформе. Они создали линии со 107 чистыми CAG (без прерывания), линии с типичным одиночным прерыванием, линии с 2 прерываниями CAA и (что наиболее драматично) линии с 4 прерываниями CAA, стратегически расположенными по всей длине повтора.

Результаты были поразительными. Двойное прерывание CAA уменьшило нестабильность по сравнению со стандартным одиночным прерыванием. Но 4 внутренних прерывания CAA, по-видимому, полностью подавили экспансию повторов в течение 120 дней. Повторы просто перестали расти как в делящихся клетках, так и в нейронах. Весьма интригующе!

Больше, чем просто стабильность

Остановка экспансии повторов сама по себе была бы ценной, но исследователи также обнаружили, что множественные прерывания CAA имели и другие преимущества, поскольку они, по-видимому, предотвращали несколько проблем, связанных с БГ, в клетках.

Нейроны со 107 CAG-повторами с обычным 1-CAA прерыванием демонстрировали трудности с развитием в правильный тип нейронов. У них было меньше маркеров, определяющих их как стриарные нейроны, и больше маркеров из другой области мозга, что предполагает, что их развитие в этот специфический тип нейронов было несколько нарушено. Эти данные согласуются с работами других лабораторий, использующих образцы мозга людей, которые показали эрозию клеточной идентичности этого типа нейронов при экспансии CAG-повторов.

Однако линия с 4-CAA прерываниями, по-видимому, поддерживала нормальное развитие стриарных нейронов. Это предполагает, что 4 прерывания CAA сохраняют генетическую идентичность стриарных нейронов!

Команда также изучила, как ДНК и другие молекулы были организованы в области, называемой ядром клеток, области, представляющей растущий интерес в исследованиях БГ. Клетки с 1 прерыванием CAA в 107 повторах имели в среднем меньшее ядро, более компактную ДНК, которая не превращается в белок, и нарушенные структуры, важные для регуляции того, какие гены остаются выключенными во время развития. 4-CAA прерывания нормализовали все эти особенности, восстанавливая размер ядра, организацию ДНК и функции, используемые для контроля уровней различных генов.

Интересно, что некоторые клеточные аспекты заболевания не улучшились благодаря прерываниям CAA. Нейроны с прерванными повторами по-прежнему демонстрировали аномальную форму клеток, аналогичную клеточной линии с 1 прерыванием CAA в 107 повторах, с более короткими нейронными ветвями (дендритами) и меньшими телами клеток. Это предполагает, что эти конкретные особенности могут зависеть от белка, кодируемого геном HTT и его повторами, а не от нестабильности ДНК или чистоты повторов.

ДНК имеет значение, а не только белок

В течение многих лет исследования БГ были сосредоточены почти исключительно на токсичном белке. Но это исследование подтверждает смену парадигмы в этой области: сама последовательность ДНК, включая ее чистоту и склонность к экспансии, по-видимому, также играет прямую роль в заболевании.

И вот тут-то становится немного дико — CAA и CAG кодируют один и тот же строительный блок белка — глутамин. Так что введение прерываний CAA на самом деле не меняет белок! Тем не менее, эти прерывания, по-видимому, предотвращают экспансию повторов и клеточные проблемы. Мы же говорили, что это дико…

Это, по-видимому, подтверждает «двухстадийную» модель БГ в отношении экспансии CAG: вы наследуете CAG-повтор, который изначально не является явно токсичным, что обычно позволяет прожить десятилетия здоровой жизни, но он расширяется в течение вашей жизни в определенных клетках мозга, пока не пересечет порог и не вызовет гибель клеток.

Хотя у некоторых исследователей есть теории о том, какая именно длина вызывает токсичность, связанную с экспансией CAG, и как именно это происходит, никто не знает наверняка. Одна из теорий заключается в том, что чистый CAG-повтор образует стабильные структуры ДНК, которые способствуют проскальзыванию и экспансии при копировании гена. Прерывания CAA могут нарушать эти структуры, предотвращая процесс экспансии.

Терапевтическая возможность?

Результаты этой недавней работы поднимают интригующий вопрос: может ли введение прерываний CAA быть терапевтическим? Недавние доказательные исследования использовали редактирование оснований CRISPR для преобразования некоторых CAG в CAA в клетках и мышах с обнадеживающими результатами. Однако перенос редактирования генов на постмитотические нейроны человека в живом мозге сталкивается с огромными техническими проблемами — эффективность доставки, точность и безопасность остаются серьезными препятствиями.

Возможно, более непосредственно, сама платформа CAGinSTEM представляет ценность для открытия лекарств. Исследователи теперь могут проверять потенциальные лекарства, которые либо уменьшают нестабильность повторов, либо смягчают ее последующие клеточные эффекты, используя эти хорошо охарактеризованные, контролируемые по качеству клеточные линии, которые, по-видимому, точно воспроизводят некоторые аспекты патологии БГ.

Естественная защита?

Исследование также намекает на интригующую возможность того, что некоторые люди могут иметь естественные внутренние прерывания CAA, которые защищают их от болезни, несмотря на наличие CAG-повторов патогенного диапазона.

Хотя такие защитные варианты никогда не наблюдались в существующих базах данных с информацией о людях, страдающих БГ, они могут существовать у бессимптомных людей, у которых никогда не развиваются симптомы.

Суть

Важно отметить, что такие исследования, которые выращивают определенный тип клеток в чашке Петри, не воспроизводят то, что происходит внутри мозга, который состоит из множества различных типов клеток, соединяющихся и взаимодействующих друг с другом. Такие исследования хорошо подходят для получения представления о том, что делают определенные типы клеток сами по себе, и как эти связанные с заболеванием изменения могут способствовать и влиять на всю систему.

Это исследование добавляет доказательств к другим работам, которые предполагают, что чистота CAG-повторов напрямую влияет как на нестабильность повторов, так и на клеточную дисфункцию при БГ, одновременно разрабатывая инструмент, который исследователи могут использовать для изучения этого открытия.

Предотвращая образование длинных, чистых CAG-последовательностей посредством стратегических прерываний, исследователи могут блокировать экспансию повторов и предотвращать множественные эффекты, связанные с БГ, в нейронах, при этом не изменяя длину глутаминового белка. Дико!

Работа продолжает менять наше понимание того, что движет патологией БГ, подчеркивая, что дело не только в белке, который вы производите, но и в последовательности ДНК, которую вы наследуете, и в том, как она меняется со временем. Хотя терапевтические применения этих открытий остаются спекулятивными, платформа CAGinSTEM предлагает исследователям мощный новый инструмент для понимания механизмов БГ и тестирования потенциальных вмешательств.

Резюме

• Платформа: Исследователи создали контролируемые по качеству линии человеческих стволовых клеток с различной длиной и составом CAG-повторов в гене хантингтина (HTT)
• Расширенное отслеживание: Используя секвенирование ДНК с длинным прочтением, они измеряли изменения CAG-повторов со временем как в делящихся клетках, так и в нейронах
• Длина имеет значение: Клеточные линии с 81-107 CAG-повторами демонстрировали линейную экспансию со временем, в то время как более короткие повторы оставались стабильными
• Чистые против прерванных: Стандартные повторы с одним прерыванием CAA в конце все еще расширялись; добавление второго прерывания CAA уменьшало экспансию
• Полная блокада: Введение 4 прерываний CAA по всей длине повтора, по-видимому, останавливало экспансию как в делящихся клетках, так и в постмитотических нейронах
• Клеточное спасение: 4-CAA прерывания предотвращали множественные клеточные эффекты БГ, включая нарушение развития стриарных нейронов, нарушенную ядерную организацию и измененные уровни генов, при этом не изменяя длину глутаминового белка
• Заболевание, обусловленное ДНК: Результаты способствуют теории о том, что чистота и нестабильность повторов, а не только длина полиглутаминового белка, напрямую определяют патологию БГ
• Инструмент для исследований: Платформа CAGinSTEM предлагает надежную систему для изучения механизмов БГ и скрининга потенциальных методов лечения